Biologische monsters

VAN CELDISRUPTIE TOT HOMOGENISATIE EN VERPULVERING VAN EEN GROTE VERSCHEIDENHEID AAN BIOLOGISCHE MATERIALEN

Het voorbereiden van biologische monsters zoals botten, planten, spieren of sputum voor analyse van DNA, RNA, eiwitten of metabolieten kan een uitdaging zijn. RETSCH levert laboratoriummolens en maalmachines die vaste monsters verpulveren en homogeniseren, maar ook geschikt zijn voor celdisruptie. RETSCH-molens worden gebruikt op gebieden als biotechnologie, diagnostiek, forensisch onderzoek, landbouw en microbiologie.

Celdisruptie van micro-organismen (in suspensie)

Celdisriuptie is vaak de voorkeursmethode om cellulaire componenten uit bacteriën, gisten, schimmels of microalgen te extraheren en wordt chemisch of mechanisch uitgevoerd. Mechanische methoden zijn beter geschikt voor cellen met harde wanden, of als de chemicaliën de extractie kunnen beïnvloeden en daarom moeten worden vermeden. Een gebruikelijke en effectieve methode is het kogelmalen, waarbij maalkogels worden gebruikt om de cellen in een suspensie te scheuren. Het impacteren met maalknikkers kan op kleine of grote schaal worden gedaan, met behulp van verschillende soorten flesjes en buisjes. Eén manier is om de suspensie met maalkogeltjes te mengen en een vortexmixer te gebruiken. Deze procedure is echter langzaam en inconsistent, vooral bij een groot aantal monsters of lange disruptietijden. Een betere manier is om RETSCH Kogeltrilmolens te gebruiken met adapters die het proces automatiseren, waardoor het snel, efficiënt en reproduceerbaar wordt .

Klik om video te bekijken

Mixer Mill MM 400 - Gist Cel Disruptie*

_{*De video toont het vorige model met hetzelfde functioneringsprincipe.}

^{Verhoogde reproduceerbaarheid van de totale eiwitconcentratie na celdisruptie, 7 min in
MM 400, 12 min Vortex.
Foutbalken: % standaardafwijking}

De MM 400 verwerkt tot 20 monsters in Eppendorf-buisjes van 1,5 of 2 ml zonder kruisbesmetting, wat tijd bespaart voor de operator. Bovendien is er een adapter verkrijgbaar voor maximaal acht Falcon-buizen van 50 ml. De optimale korrelgrootte voor celverstoring varieert afhankelijk van het celtype; voor bacteriën en gisten worden glasparels van 0,75 tot 1,5 mm aanbevolen, terwijl kleinere kralen binnen het bereik van 0,1 tot 0,5 mm geschikter zijn voor schimmels en microalgen.

Voor DNA- of RNA-extractie zijn kleinere Tubes voor eenmalig gebruik tot 2 ml ideaal, terwijl grotere injectieflacons zoals de Falcon-buizen van 50 ml zeer geschikt zijn voor de verwerking van eiwitten of metabolieten. De optimale kogelmaalparameters variëren afhankelijk van het celtype. Het kan wat experimenteren vergen om de beste resultaten te vinden. Normaal gesproken zijn 30 seconden (de meeste microalgen) tot 7 minuten (gisten in het algemeen) nodig om de cellen volledig te vernietigen.

Door maximaal vijftig 2 ml injectieflacons voor eenmalig gebruik te accepteren, verhoogt de Kogeltrilmolen MM 500 vario effectief de monsterdoorvoer.

Cellen van Phaeodactylum tricornutum voor (links) en na celverstoring (rechts) met de Mixer Mill MM 400 in combinatie met de Falcon buisadapter.

Temperatuurregeling voor het kogelmalen in een celsuspensie

Vooral bij toepassingen waarbij temperatuurgevoelige eiwitten betrokken zijn, speelt temperatuur een cruciale rol. Eén oplossing is cryogeen malen (zie overeenkomstige sectie), de andere is het afkoelen van de celsuspensie. Voor de MM 400 werd aangetoond dat de warmtetoename in buizen van 2 ml zelfs bij 30 Hz gematigd is; een eenvoudige manier is om het maalproces te onderbreken voor tussentijdse koeling in een ijsbad gedurende 1 minuut. Op deze manier zal de temperatuur onder de 12-15°C blijven, afhankelijk van de gebruikte kogelgrootte.

^{Temperatuurstijging tijdens celverstoring in de MM 400 bij 30 Hz, of met een Vortexer, afkoelen op ijs na elke minuut celdisruptie}

Een manier om de temperatuurontwikkeling bij het kogelmalen te controleren is het gebruik van de Mixer Mill MM 500-control. Een speciale adapter biedt plaats aan achttien flacons van 2 ml voor eenmalig gebruik per batch. De machine is aangesloten op een koelmachine met gekoeld water van 4°C, dat op zijn beurt de adapter koelt die de flesjes vasthoudt. Op deze manier wordt de temperatuur van de suspensie rond de 13°C gehouden, maar zonder de lastige handmatige onderbrekingsfasen in een ijsbad. Hoewel de MM 500-control de Falcon-buisadapter voor eenmalig gebruik niet accepteert, kan deze worden gebruikt met roestvrijstalen maalbekers in volumes van 50, 80 of 125 ml (zie voorbeeld links: P. pastoris ).

Als de molen wordt gebruikt met vloeibare stikstof en de CryoPad en wordt ingesteld op een temperatuur van 0 °C, kan de temperatuur van de celsuspensie in wegwerpbuisjes van 2 ml zelfs op 0 °C worden gehouden zonder dat de suspensie bevriest, waardoor effectieve kogelvermaling nog steeds mogelijk is.

Homogenisatie van zachte en taaie biologische monsters

Sommige biologische monsters, zoals sputum van patiënten met cystische fibrose of weefselmonsters zoals lever-, long- of tumoren, zijn soms moeilijker volledig te homogeniseren. De buisjes van 2 ml voor eenmalig gebruik zijn vaak te klein om in het gehele monstervolume te passen. Daarom moet het monster na het homogenisatieproces worden gesplitst en opnieuw gecombineerd, wat extra werk en tijd aan de laboratoriumroutine toevoegt.

Grotere maalbekers van roestvrij staal kunnen bijvoorbeeld het hele monstervolume bevatten, maar moeten na elk gebruik worden gereinigd. Een adapter voor de Kogeltrilmolen MM 400 lost dit probleem op door het gebruik van 5 x 5 ml tubes voor eenmalig gebruik, die meer capaciteit hebben en geen schoonmaakbehoefte hebben. Per batch kunnen dus 10 monsters gelijktijdig worden gehomogeniseerd. Falcon-buizen van 50 ml kunnen ook worden gebruikt om weefselmonsters te homogeniseren. Hier kunnen binnen slechts enkele minuten 8 monsters per batch worden verwerkt.

Levermonster voor en na homogeniseren in de MM 400

Cryogeen malen van biologische monsters

Sommige biologische monsters, zoals vezelige planten, taaie aderen, vingernagels of bepaalde dierlijke of tumorweefsels, zijn moeilijk te homogeniseren in een buffersysteem. Ze zijn te zacht, te hard of te vezelig om effectief in suspensie te worden verpulverd. Een beter alternatief voor deze monsters is cryogeen malen, waarbij ze voor of tijdens het maalproces worden diepgevroren met vloeibare stikstof. Deze techniek maakt de monsters bros en gemakkelijk te vermalen tot homogene poeders. Cryogeen malen heeft ook het voordeel dat de integriteit behouden blijft van bvb. eiwitten of vluchtige verbindingen die bij hogere temperaturen kunnen worden afgebroken of verdampen. Bovendien kan cryogeen malen de intracellulaire organellen van sommige organismen, zoals gist, breken.

Voor monsters die kleverig zijn, zoals bessen, is cryogeen malen vaak de enige haalbare methode om een uniform monster te verkrijgen. De tabel bevat enkele voorbeelden van monstermaterialen die met succes zijn verwerkt door cryogeen malen in de Kogeltrilmolen MM 400 of de CryoMill. Roestvrijstalen buisjes van 2 ml kunnen worden gebruikt voor cryogeen malen in de MM 400. Soortgelijke effecten kunnen worden verkregen in de MM 500 control met maalbekers tot 125 ml voor grotere monstervolumes. Hier moet de CryoPad worden gebruikt om met vloeibare stikstof te werken. In alle genoemde molens zijn ook roestvrijstalen buisjes van 2 ml en de bijbehorende adapters beschikbaar voor kleinere monstervolumes.

^{2 ml roestvrij stalen buisjes}

Sample	Toebehoren	Toevoer hoeveelheid	Grinding time	Speed	Eindfijnheid (d90)/
E. coli bacteria	2 maalbekers RVS 50 ml 2 maalkogels 25 mm RVS per maalbeker	2 x 10 ml bevroren celpellets	2 min	30 Hz	volledige celdisruptie
muscle tissue	maalbeker RVS 50 ml maalkogel 25 mm RVS	10 g	4 min	25 Hz	<150 µm
pine needles	2 adapters voor elk tien reactietubes van 2 ml 2 x kogeltjes roestvrij staal 5 mm per buisje		3 min	30 Hz	Reproduceerbare RNA-extractie van 20 monsters in één stap
berries	maalbeker RVS 50 ml 4 x maalkogels RVS 15 mm	2 g	40 secs	20 Hz	<200 µm
finger nails	adapter CryoMill voor 4 x 2 ml flesjes 4 roestvrijstalen maalkogels	1 vingernagel per flacon	2 min	25 Hz	<200 µm
rat gut	maalbeker RVS 35 ml 1 x maalkogel RVS 20 mm	1.8 g	2 min	30 Hz	<150 µm

^{Stukken vlees voor en na het cryogeen malen}

^{Kleverige bessen
voor en na cryogeen malen}

^{Dennennaalden
voor en na het cryogeen malen}

^{Agarose gel voor RNA scheiding van vermalen dennenaalden toont goede reproduceerbaarheid en hoeveelheid geprepareerd RNA}

Forensische monsters

Forensische monsters zoals haar, botten en tanden zijn meestal broos en hoeven daarom meestal niet te worden gekoeld voordat ze worden verpulverd. Om de gewenste analytische fijnheid te bereiken, moeten de monsters mogelijk eerst worden vermalen in een Kaakbreker of Snijmolen om hun deeltjesgrootte te verkleinen tot minder dan 10 mm voor verdere verwerking in een Kogelmolen. Snijmolens worden gebruikt voor het voorvermalen van botten die vers en daardoor niet helemaal droog kunnen zijn en zelfs vleesresten kunnen bevatten.

RETSCH biedt een assortiment snijmolens voor de primaire verkleining van zachte, middelharde , elastische, taaie en vezelige monstermaterialen. Het brede assortiment accessoires maakt een optimale aanpassing aan verschillende toepassingen mogelijk. De SM 300 kan worden uitgerust met drie verschillende rotoren en bodemzeven van 0,25 mm tot 20 mm. In tegenstelling tot verse en vette botten kunnen droge botten in één of twee stappen worden verkleind tot een grootte van minder dan 0,25 mm. De SM 300 beschikt over een variabel toerental van 100 tot 3.000 tpm. Verpulvering van botten, tanden of haar wordt meestal uitgevoerd in kogelmolens met behulp van maalkogels

^{Beendermonster voor en na malen in een snijmolen}

^{Menselijke haren voor en na fijnmalen in een kogeltrilmolen}

Wasprocedure om intacte bacteriecellen uit menselijk weefsel te verkrijgen

Een van de mogelijke complicaties van gewrichtsvervangende operaties, zoals bij ellebogen of knieën, is de infectie van het omliggende weefsel door verschillende bacteriën. Deze infecties, genaamd prothetische gewrichtsinfecties (PJI), kunnen op elk moment van een paar dagen tot meerdere jaren na de operatie optreden. Ze zijn moeilijk te behandelen omdat verschillende soorten bacteriën ze kunnen veroorzaken, en ze worden niet altijd met conventionele methoden gedetecteerd. Daarom is het noodzakelijk om de bacteriën uit de weefselmonsters te isoleren op een manier die hun levensvatbaarheid behoudt en hun identificatie en cultivering mogelijk maakt.

Dit is waar de Kogeltrilmolen MM 400 u kan helpen met een eenvoudige procedure: de monsters worden gemengd met 20 ml steriel gedemineraliseerd water en 5 ml glasparels van 1 mm in een gesteriliseerde stalen pot. Er kunnen wijdmonds-wegwerpflessen van 30 ml worden gebruikt. Maximaal 8 flessen worden gedurende 3,5 minuten bij 30 Hz geschud om de bacteriën uit de monsters te verwijderen zonder ze te vernietigen. De bacteriën kunnen vervolgens eenvoudig op een agarplaat worden gekweekt voor verdere analyse. Deze methode heeft een hoog detectiepercentage (A.-L. Roux et. al 2010) en kan worden toegepast op elk vast geïnfecteerd weefselmonster, zelfs als het geïmplanteerd materiaal bevat.